ROTİFER KÜLTÜRÜ

ROTİFER KÜLTÜRÜ
Rotifer (Brachionus plicatilis), 1950 – 1960  yılları arasında Japonya’da yılan balığı yetiştiriciliği yapılan havuzlarda oksijen eksikliğine sebep olduğundan çiftliklerde asalak olarak görülmüştür. 1965 yılında Japon uzmanlar tarafından kırmızı mercan (Pagrus major) larvalarının ilk beslenmesinde canlı yem olarak kullanılabileceği ortaya konmuştur. Daha sonra, rotifer yetiştiricilik teknikleri geliştirilmiş ve dünya çapında uygulanmaya başlanmıştır. Rotiferin büyük miktarlarda üretimi su ürünleri yetiştiriciliğinin gelişimine önemli katkılarda bulunmuş ve günümüzde rotifer kullanılarak 60’dan fazla deniz balığı türü yetiştirilebilmektedir.

Rotifere filumu akuatik yada yarı-akuatik omurgasızların nispeten küçük bir grubu olup, yaklaşık 2,000 türden oluşmaktadır. Su ürünleri yetiştiriciliğinde ise sadece iki türü kullanılmaktadır: Brachionus plicatilis (B. plicatilis) ve Brachionus rotundiformis  (B. rotundiformis). Bu iki tür morfolojik özellikleri ile farklılık göstermektedir: B. plicatilis’de lorika (silli taç) uzunluğu 130–340µm (ortalama 240 µm), B.rotundiformis’de ise 100–210 µm (ortalama 160µm) arasında değişmektedir. Ayrıca, B. plicatilis’in lorikası geniş açılı dikenlere, B.rotudiformis’inki ise sivri uçlu dikenlere sahiptir.

 B. plicatilis ve B. rotundiformis optimum büyüme-gelişme sıcaklıkları bakımından da farklılık gösterirler. Genel olarak, optimum büyüme sıcaklığı B. plicatilis’de 20-25oC arasında, B. rotundiformis’de ise 30oC civarı olarak gözlenmiştir.

Kalkan balığı yetiştiriciliğinde erken larva aşamasında, larvanın ağız açıklığının küçük olması nedeniyle canlı yem olarak rotifer kullanılması gerekmektedir. Proje çerçevesinde, kalkan larvaları için uygun su sıcaklığı 21oC civarında olduğundan ve bu sıcaklıkta optimum gelişme gösterebilen B. plicatilis türü üretilmiştir..

Rotiferlerin (B. plicatilis) projede uygulanan kültür prosedürü altı küçük ölçekli stok geliştirme safhası ile bir nihai yoğun kültür safhasını içermektedir. Bu prosedürlerin detayları aşağıda verilmiştir.

Stok kültürü®200 ml kültür®5 l balonjoje kültür® 30 l su banyosunda kültür tankı®200 l kültür®1m3 kültür®3,4 m3 kültür®Hasat

a. Kültür Geliştirme

Küçük Ölçekli Üretim

Küçük ölçekli rotifer kültürü, deney tüpleri, 200 ml erlen ve 5 litrelik balonjojelerde inkübatörlerde gerçekleştirilir. İnkibatörlerin sıcaklığı 18oC’de muhafaza edilir ve havalandırma yapılmaksızın küçük hacimlerde rotifer kültürü yapılır. Rotifer besini olarak kullanılan fitoplankton (Nannochloropsis veya  Phaeodactylum)’ un zemine çökelmesinden kaçınmak amacıyla rotifer kültürünün bu aşamasında nispeten hareketli bir alg türü olan Tetraselmis sp. kullanılmaktadır.

Test Tüp Stok Kültürü

Rotiferin test tüplerine ekimi 1 rotifer/ml başlangıç yoğunluğu ile yapılır. Tüpteki Tetraselmis’in yoğunluğu yaklaşık 2x106  hücre/ml olacak şekilde ayarlanır. Bir hafta sonra, alg verilmeden rotifer yoğunluğu 1’den 50 rotifer/ml’ye ulaşır. Stokun sürekliliği için test tüpündeki rotiferin bir kısmı yeni test tüplerine aktarılır. Kalan rotifer ise kültürün bir sonraki safhası için kullanılabilir.

200 ml’lik Hacimlerde Rotifer Kültürü

Rotifer transfer edilmeden önce sterile edilmiş erlenmeyere 20 ml taze Tetraselmis ilave edilir. Test tüp içerisindeki rotiferler dipte biriken atıkları dağıtmadan steril bir pipetle yavaşça toplanarak erlene aktarılır.  Zaman zaman erlenin hacmi 150 ml oluncaya kadar taze alg kültürü ilave edilir. Rotiferin yoğunluğu yaklaşık olarak bir haftada 20’den 150 rotifer/ml’ye ulaşmaktadır.

5 l ‘lik Hacimlerde Rotifer Kültürü

200 ml’lik erlen içerisindeki rotifer, kap yana yatırılarak yavaşça 5 l’lik cam balona aktarılır. Dipte biriken sedimentlerden gelebilecek olası kontaminasyonu önlemek amacıyla erlen dibinde kalan 1/3’lük kısım dışarıya boşaltılır. 5 l’lik kaplara ekim yapıldıktan sonra, rotiferler 200 ml saf Tetraselmis ile beslenir. Rotiferlere yeterli besin sağlayabilmek için, ekimden iki gün sonra kültür hacmi 4 l’ye ulaşıncaya kadar günde 200 - 500 ml saf alg (Tetraselmis 5x 106 hücre/ml veya Nannochloropsis 50x106 hücre/ml) verilmelidir. Yaklaşık bir hafta içerisinde rotiferin sayısı 50’den 150 rotifer/ml’ye ulaşır. Bu safhada havalandırma gerekmemektedir.

Orta Ölçekli Kültür

Orta ölçekli kültür, 30 l’lik polikarbon, 200 l’lik FRP ve 1 m3 siyah polikarbon tanklarda yapılmaktadır. pH, sıcaklık ve benzeri çevre şartlarındaki ani değişiklerden sakınmak için tanklar gölgelik bir alana yerleştirilir. Elektrikli ısıtıcılar kullanılarak kültür ortamının sıcaklığı 18oC olarak ayarlanır. Fekal atıkları, ölü rotiferleri ve birikebilecek diğer atıkları toplamak amacıyla bir kaç parça poliester filtre kültür içerine asılı olarak yerleştirilir. Serada üretilen taze alg bu aşamada rotiferlere besin olarak verilir. Bu safhada orta derecede havalandırma uygulanmaya başlanır.

30 l‘lik Hacimlerde Rotifer Kültürü

Klorin solüsyon ile steril edilmiş 30 l’lik kültür tankları su banyosuna yerleştirilir. 5 l’lik balonjojelerdeki rotiferler aşılanmadan bir gün önce 5 l saf Nannochloropsis (20x106 hücre/ml ) 30 l’lik tanklara transfer edilir ve orta derecede havalandırma (3.5 l/dak) sağlanır. Rotifer tanka aşılandıktan sonra, tanktaki alglerin iki gün içerisinde tüketilmesiyle suyun rengi yarısaydam açık yeşilden, şeffaf açık yeşile dönüşür.  Bundan sonra rotiferler her gün  3– 6 l taze Nannochloropsis ile tankın hacmi 30 l ye ulaşıncaya kadar beslenir. Tanktaki rotifer yoğunluğu bir hafta içinde 75 rotifer/ml’den 200 rotifer/ml’ye ulaşır.

200 l ve 1 m3 Hacimlerde Rotifer Kültürü

Rotifer aşılanmadan iki gün önce, 200 l gri renkli, pürüzsüz iç yüzeye sahip dörtgen FRP ve 1 m3 silindirik tanklar klorin solüsyon ile steril edilir. Ertesi gün, tank hacminin %30’u hücre yoğunluğu 7.5x106 hücre/ml civarında olan Nannochloropsis ile doldurulur. 200 l’lik dörtgen tanklarda 4 l/dak, 1 m3’lük tanklarda ise  6 l/dak. olacak şekilde havalandırma ayarlanır.

Protozoa, Aspidisca sp., besin için rotiferle rekabete girer ve kültürün bu safhasında nadiren de olsa görülebilmektedir. Bu protozoa türünü kültür ortamından uzaklaştırabilmek için rotiferler itinalı bir şekilde yıkanır. Rotiferin aşılanmasına başlanmadan önce orijinal tank (200 l için 30 l ve 1 m3 için 200 l) içerisindeki büyük sedimentlerin dibe çökmelerini sağlamak amacıyla havalandırma durdurularak 10 dakika dinlendirme yapılmalıdır. Daha sonra, rotiferler sifonlanarak tank içerindeki su seviyesi 5 cm’ye düşünceye kadar, su içerisine yerleştirilen plankton ağ içerisinde (ağ göz açıklığı 80 µm) toplanırlar. Bu durumdaki rotiferler ısıtılmış steril deniz suyuyla iyice yıkanır.

Rotiferin aşılama yoğunluğu 75 ile 100 rotifer/ml arasında değişmektedir. Tanktaki alg rotifer tarafından  bir gün içerisinde tüketilir ve tanktaki suyun rengi açık yeşile dönüşür. Kültür suyunun arzulanan rengini muhafaza edebilmek için günlük olarak tanka hacminin %20’si taze Nannochloropsis (20x106 hücre/ml) bir pompa yardımıyla ilave edilir. Rotifer yoğunluğu giderek artar ve 3. Günden itibaren başlangıç olarak maksimum 0.4 g/106 rotifer oranında kuru ekmek mayası verilmeye başlanır. Tank içerisindeki rotifer yoğunluğu bir hafta içerisinde 200 rotifer/ml’yi aşar.

b. Yoğun (Kitlesel) Rotifer Kültürü

Yoğun veya kitlesel rotifer kültüründe yaygın olarak kullanılan iki standart kültür sistemi mevcuttur. Bunlardan birincisi ‘Parti (beç) kültür sistemi’ diğeri ise ‘İşletme (yarı-sürekli) kültür sistemi’dir.

İki sistem arasındaki temel farklılık olgunlaşan kültürün hasat şeklindedir. Parti kültür sisteminde tanktaki yetiştirilen rotiferin tamamı aynı anda veya bir defada hasat edilir.  Hasat edilen bu rotiferin bir kısmı yeni tanklara ekim amacıyla kullanır. İşletme veya yarı-sürekli kültür sisteminde ise bir tanktaki rotifer birkaç gün süreyle hasat edilir ve her defasında hasat edilen hacim kadar taze alg kültürü ilave edilir. Genel olarak, “parti” sistemindeki kültür döngüsü, yarı-sürekli kültür sisteminden daha kısadır.

Rotifer Sayımı

Kültür ortamının genel durumunu, rotifer yoğunluğunu ve verimliliği belirlemek amacıyla  her tanktan günlük olarak alınan örnekler stereo mikroskop (40x büyütme) altında incelenir. Bu amaçla en azından 1 ml örnek zooplanton sayım kamarası üzerine yayılır ve ilk olarak siliata, nematoda ve protozoa gibi arzulanmayan mikroorganizmaların varlığı kontrol edilir. Örnekteki rotifer ve protozoaları öldürmek amacıyla bir damla Lugol iyodin solüsyonu ve formalin damlatılır. Mikroskop ve çoklu sayaç yardımıyla örnekteki toplam rotifer, yumurtalı rotifer, toplam yumurta ve protozoa sayıları ayrı ayrı belirlenir. Toplam yumurtalı rotifer sayısı toplam rotifer sayısına bölünerek rotiferin yumurtlama (verimlilik) oranı tahmin edilir. Bir günlük kültürün %30-40 verimlilik oranına sahip olması beklenir. Bu oran kültür süresinin uzunluğuna göre dereceli olarak azalmaktadır. Genel olarak %10’ un altında verimliliğe sahip bir kültürün populasyonu yenilemesi zorlaşmaktadır.

Dört Günlük B. plicatilis Parti Kültür Sistemi

4 günlük bir parti kültür sistemi sıcaklık kontrollü bir odaya yerleştirilen 6 adet 750 l’lik silindiro-konik  tank setinde yapılmaktadır. Sıcaklık, radyatöre bağlı kalorifer sistemiyle 19-23oC arasında muhafaza edilmektedir. Şekil 4’de projede uygulanan tipik bir 4-günlük B. plicatilis parti kültür sistemi görülmektedir.

 0. günde, tanklar 20x106  hücre/ml yoğunluğunda 250 l alg ve 250 l steril deniz suyu ile doldurulur. Karışım tank hacminin 500 l’sini doldurur ve alg yoğunluğu yaklaşık 10x106 hücre/ml olur. Bu işlemden sonra yoğunluğu 100 rotifer/ml yoğunluğunda rotifer ekimi yapılır. Tankın ortasına bir adet hava taşı yerleştirilerek hafif bir su sirkülasyonu (havalandırma 7.5 l/dakika) sağlanır.

1. günün sabahı yoğunluğu 20x106 hücre/ml olan 250 l alg kültürü ile tanklar 750 l seviyesine kadar doldurulur. Tankın içerisine sudaki atıkların toplanmasını bir parça (50x80cm) hava temizleme filtresi asılı halde yerleştirilir. Öğleden sonra, kuru ekmek mayası bir blendırda su ile homojenize edilerek, 0.2 g/106 rotifer oranında yem olarak verilir.

2. ve 3. günlerde yem olarak yukarıda bahsedilen oranda homojenize edilmiş ekmek mayası sabah ve öğlenden sonra kültür tanklarına verilir. Sabahları filtre materyalleri yıkanarak tekrar yerleştirilir.

4. gün sabahı tanktaki tüm rotifer hasat edilir. Hasat edilen rotiferin 1/3’ü yeni hazırlanan tanka yukarıda 0. gün açıklandığı gibi aşılanır.

Hasattaki rotifer yoğunluğunun 200 rotifer/ml’nin üzerinde olması beklenir. 750 l’lik bir tanktan inokülasyonda kullanılacak olan miktar hariç, yaklaşık olarak 100x106 rotifer üretilebilir.

Şekil 4.  B. plicatilis’in dört gün kültür sistemi (*SDS: Steril Deniz Suyu)

N-Günlük İşletme (yarı-sürekli) Kültür Sistemi

N – gün yarı-sürekli kültür sistemi sera içerisindeki 3.4 m3’lük 4 set dikdörtgen FRP tanklar kullanılarak yapılmaktadır. Tanklardaki sıcaklık radyatör ısıtma sistemi kullanılarak 16oC civarında muhafaza edilir. Kültür suyunun sirkülasyonu için, 1.5 cm yarıçapında x 1.6 m uzunluğunda bahçe hortumu 2 cm aralıklarla 1 mm çapında  dikiş makinasında delinerek tank duvarın bir köşesinden 5 cm uzağa, tank dibinden 5 cm yukarıda ve paralel olacak şekilde ısıtıcıya monte edilir. Havalandırma hortumun karşısındaki duvara ise 40x60 cm boyutunda bir filtre kutusu yerleştirilir. Kültür ortamı hava borusu ile kutu filtre sisteminden geçirilerek filtre edilmesi sağlanır.

0. günde tanklara 750 l (%22) yoğunluğu yaklaşık 20x106 hücre/ml olan Nannochloropsis ve 750 l steril deniz suyu doldurulur. Bu karışımın toplam hacmi 1500 l ve içerisindeki Nannochloropsis’in yoğunluğu ise 10x106 hücre/ml olup, tank hacminin yaklaşık %44’nü doldurur. Hazırlanan tanka 50-100 rotifer/ml yoğunluğunda rotifer ekimi yapılır.

1. gün sabahı, tanklara 750 l taze alg ilave edilir ve tank hacminin 2.250 l’si dolar. Öğleden sonra blender yardımıyla homojen hale getirilmiş  0.2 g/ 106 rotifer oranında kuru ekmek mayası ile besleme yapılır.

2. gün sabahleyin, tanklara 750 l taze alg ilave edilerek tankın toplam hacmi 3 000 l’ye ulaşır. Sabah ve öğleden sonra olmak üzere günde iki kez 0.2 g/106 rotifer oranında ekmek mayası verilir. Bu aşamada filtre kutusu kullanılarak kültür ortamının filtrasyonuna başlanır.

3. gün sabahında, tanklara 400 l alg daha ilave edilerek tank tamamen (3400 l) doldurulur. Rotiferler günde iki kez (sabah ve akşam) 0.2 g /106 rotifer oranında maya ile beslenir. Filtre materyalleri yıkanır ve tekrar yerleştirilir.

4. günden N-1 güne kadar kısmi hasat yapılarak hasat edilen hacimde taze alg ilave edilir. Günlük işletme veya hasat oranı genellikle %10–30 arasında değişmektedir. Normal kültür şartlarında, ekmek mayası (0.4 g/106 rotifer/gün) ve alg kombinasyonu kullanılarak rotiferin gelişimi sürdürülebilir. Rotiferin üreme oranı azaldığında, söz konusu tanka birkaç gün süreyle verimlilik tekrar %15’in üzerine çıkıncaya kadar 1– 2 l konsantre edilmiş Nannochloropsis (5x109 hücre/ml) ilave edilir. N. günde tankın tamamı hasat edildikten sonra, döngü aynı şekilde tekrar edilir.

Hasat

Rotiferin hasadına başlamadan önce, drenaj borusu içerisindeki durgun su boşaltılarak deniz suyu ile yıkanır. Drenaj borusunun vanası açılır, 80 µm’lik naylon ağ kepçe (30x60 cm) kullanılarak rotiferler hasat edilir. Hasat esnasında olabilecek taşma veya tıkanmanın önlenebilmesi için sürekli kontrol yapılmalıdır. Ağ kepçenin ara sıra yavaşça silkelenmesi ağ gözünün tıkanmasını ve dolayısıyla taşmayı önler. Ayrıca, rotiferlerin oluşabilecek hava kabarcığıyla yapışmasını önlemeye özen gösterilmelidir. Eğer bu sorun ortaya çıkarsa yüksek oranlarda rotifer ölümü  gözlenir.

Kitlesel Yumurta İzolasyon Teknikleri

Kalkan yetiştiriciliğinde, larva ve ergin balıklarda yüksek oranda ölümlere neden olan siliatlar en önemli parazitlerden biridir. Bu parazitin kültür tanklarına bulaştığı görüldüğünde, kültürün yenilenmesi tavsiye edilir. Bu nedenle, kültürün kısa sürede tekrar kazanılmasında yoğun veya kitlesel yumurta izolasyon tekniğinin uygulanması etkin olabilir.

Rotifer yumurtalarının, rotiferlerin vücutlarından ayrılmasında şu prosedür izlenmektedir: Yaklaşık 200 l rotifer hasat edilerek 120 µm’luk ağ hasat kepçesinde toplanır ve blendere boşaltılır. 10 saniye süreyle rotifer homojenize edilerek ezilen rotiferlerden yumurtaların ayrılması sağlanır. İki tip filtre kullanılarak homojenize edilmiş rotifer ile yumurtaları ayrılır. 120 µm’luk üst filtre ile rotiferler, 80 µm’luk alt filtre ile de yumurtalar toplanır. Yumurtalar steril deniz suyuyla iyice yıkanır. Rotiferlerden bazıları hala canlı olarak yumurtaların arasında kalabilir. Söz konusu arzulanmayan rotiferleri yok etmek amacıyla 80 µm’luk filtrede toplanan yumurtalar tekrar 10 saniye süreyle homojenize edilir. Ayrılan yumurtalar tekrar steril deniz suyuyla yıkanır. Temizlenen yumurtalar, 100 l deniz suyu ve 400 ppm klorin-dioksit (ClO2) içeren taze alg ile doldurulmuş silindiro-konik tankta inkübasyona tabi tutulur.

c. Rotifer Zenginleştirilmesi

Yoğun kültürü yapılan rotiferin besin değeri, larvanın gelişimi için ihtiyacı olan besinsel değeri, özellikle HUFA (yüksek doymamış yağ asidi) yönünden yetersizdir. Ayrıca, bir çok çalışmada belirtildiği gibi kalkan larvalarının üst kısımlarında gözlenen pigmentasyon anormalliğinin canlı yem organizmalarının kalitesi tarafından önemli oranda etkilendiği bilinmektedir. Bu bakımından, rotiferin besin değerinin artırılması larva kültürü  için bir gereksinimdir.

Proje çalışmaları sırasında deneme amaçlı rotifer zenginleştirme uygulaması yapılmıştır. Bu amaçla hasat edilen rotifer 750 l’lik 400 ppm ClO2 içeren deniz suyu ile doldurulmuş silindiro-konik bir tanka transfer edilir. Rotifer yoğunluğu 500 rotifer/ml’den düşük stoklanır ve herhangi bir besin verilmeksizin orta derecede havalandırmayla  (7.5 l/dakika) muhafaza edilir.

Rotiferler 4 saat aç bırakıldıktan sonra ortama zenginleştirici ilave edilerek işleme başlanır. Bu amaçla, konsantre edilmiş Phaeoductylum (2x106 hücre/ml) ve ticari HUFA içeriği zengin yağ (0.15 g/106 rotifer)  zenginleştirme tankına verilir. Ayrıca, zenginleştirme tanklarına larvalara verilecek rotiferin bakteri sayısını en az seviyeye indirmek amacıyla 3 ppm sodium nifurstirenat asit ilave edilir. Rotiferin havalandırma sırasında hava kabarcığı ve yağ ile birleşmesini önleyebilmek için havalandırmanın çok dikkatli bir şekilde ayarlanması gerekir. HUFA’nin oksidasyonunu önlemek için su sıcaklığı elektrikli ısıtıcı kullanılarak 22oC’de muhafaza edilir. Bu sıcaklığın üzerindeki değerler HUFA’nın oksidasyonuna neden olmaktadır.

Zenginleştirmeye başlandıktan 16 saat sonra, aynı oranda HUFA’ca zengin yağ ilave edilir. 17. saatin sonunda zenginleşmiş rotiferin hasadına başlanır.

 

KAYNAK : http://www.sulusozluk.org/rotifer-kulturu-459.html

Güzel bilgiler, paylaşım için teşekkürler.

Rotifer üreticeklerin işine yarayabilir.

Merhaba,ben rotifer üretmek istiyorum ama rotifer yumurtası nerden ve nasıl alabilirim yardımcı olursanız sevinirim. Teşekkürler.GETz READY2013-10-19 13:28:01

[QUOTE=aydien]
Merhaba,ben rotifer üretmek istiyorum ama rotifer yumurtası nerden ve nasıl alabilirim yardımcı olursanız sevinirim. Teşekkürler.editededitIDGETz READY/editIDeditDate2013-10-19 13:28:01/editDate/edited[/QUOTE]

Bende denemek isterim bulduğunuzda yada ' aydien (bey/hanım) a ' gönderen bana da ulaştırırsa sevinirim.
İyi hobiler

Çok güzel paylaşımlar teşekkürler